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大鼠角膜成纖維細胞提取物培養步驟

瀏覽次數:108發(fā)布日期:2024-06-27

大鼠角膜成纖維細胞提取物培養步驟:

一.培養基及培養凍存條件準備:

1)準備MEM培養基(MEM:GIBCO,貨號11095-080),85%;北美胎牛血清(United States,GIBCO,貨號16000-044),15%。

2)培養條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養箱濕度為70%-80%。

3)凍存液:90%*培養基,10%DMSO,現用現配。液氮儲存。

二.細胞處理:

1)復蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過(guò)夜(或將細胞懸液加入10cm皿中,加入約8ml培養基,培養過(guò)夜)。第二天換液并檢查細胞密度。

2)細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養。

對于貼壁細胞,傳代可參考以下方法:

1.棄去培養上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養瓶中,置于37℃培養箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀(guān)察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養基,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養液后吹勻。

4.將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

3)細胞凍存:待細胞生長(cháng)狀態(tài)良好時(shí),可進(jìn)行細胞凍存。貼壁細胞凍存時(shí),棄去培養基后加入少量胰酶,細胞變圓脫落后,加入約1ml含血清的培養基后加入凍存管中,再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。


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